روش مولکولی PCR در تشخیص عوامل عفونی و بیماری ها
جایگاه PCR در تشخیص آزمایشگاهی
روشهایی که جهت شناسایی عوامل عفونی بیماری ها به کار می روند، شامل کشت میکروبی، روشهای سرولوژیک و روش های مولکولی می باشند، کشت میکروبی نیاز به زمان طولانی برای رسیدن به پاسخ دارد و این در حالی است که میکروارگانیسم های بیماری زای مهمی نیز وجود دارند که به سختی قابل کشت بوده یا اصلاً قابل کشت نیستند.
روشهای سرولوژیک نیز دارای معایبی از جمله واکنش متقاطع (Cross Reaction) با عوامل مختلف، عدم حساسیت در تشخیص برخی عفونتهای مادرزادی مانند CMV، عدم کارایی مناسب در افراد دارای نقص ایمنی و نبود تستهای سرولوژیک در مورد برخی از ارگانیسم های بیماریزا می باشند.
از آنجائیکه شناسایی دقیق و سریع عوامل عفونی از مطالبات مهم جامعه پزشکی می باشد، روشهای مولکولی در موارد زیادی جایگزین روشهای فوق گشته اند. در میان روشهای مولکولی، روش(PCR (Polymerase Chain Reaction و مشتقات آن از جمله Real-Time PCR گستردگی روزافزونی در شناسایی عوامل عفونت زا یافته اند، این روش که بر مبنای شناسایی و تکثیر ژنوم میکروارگانیسم ها عمل می کند، دارای حساسیت بسیار بالایی در تشخیص می باشد بطوریکه قادر است تعداد بسیار اندک پاتوژنها را که با روشهای دیگر قابل شناسایی نیستند، تشخیص دهد.
این توانایی به طور مثال در مراحل اولیه عفونت که پاتوژن با روشهای دیگر قابل تشخیص نمی باشد، بسیار ارزشمند است. همچنین این روش دارای ویژگی (Specificity) و نیز سرعت پاسخدهی بسیار بالایی می باشد. سرعت پاسخ دهی بالا یکی از ضروریات تشخیص برخی بیماری های حاد عفونی است که به عنوان مثال می توان به بیماریهای عفونی مغزی-نخاعی یا سپتیسمی اشاره کرد که تشخیص سریع عامل عفونت کمک موثری در درمان بیماران می نماید.
مزایای روش PCR
توانایی تشخیص عوامل عفونی در مراحل ابتدایی که با روش های دیگر قابل شناسایی نیستند .
دارای بیشترین ویژگی، دقت و سرعت پاسخدهی نسبت به سایر روشهای معمول .
توانایی در تعیین تعداد عوامل بیماری زا از جمله CMV و HBV,HCV .
تعیین ژنوتیپ های ویروس ها بخصوص CMV و HBV,HCV .
تعیین مقومت دارویی عوامل عفونی.
یکی دیگر از مزایای مهم این تکنیک، توانایی آن در تعیین کمیت (Quantity) پاتوژنها می باشد که خصوصاً در مورد برخی عوامل ویروسی مانند ویروسهای عامل هپاتیت C و B ، HIV و CMV اهمیت فراوانی دارد. همچنین حساسیت، ویژگی و سرعت این روش در تعیین جنسی، گونه و تحت گونه میکروارگانیسم ها (typing) در موارد زیادی مانند تعیین ژنوتیپ ویروس های HSV و HCV می تواند روند درمان بیماری را کاملا تغییر دهد.
با گسترش کاربرد این روش ها، امروزه شناسایی دقیق مقاومت دارویی برخی از پاتوژنها با استفاده از این تکنیکها میسر گشته است. در این راستا شناسایی مقاومت ویروس هپاتیت B به داروی لامیوودین را می توان به عنوان نمونه ذکر نمود که در تصمیم گیری پزشکان جهت ادامه درمان حائز اهمیت فراوانی است با توجه به ویژگیهای مذکور، آزمایشگاه تشخیص طبی سعید با راه اندازی بخش تشخیص مولکولی، اقدام به ارائه خدمات در این زمینه به جامعه پزشکی نموده است.
بخش مذکور با استفاده از کادر علمی مجرب و فناوری های روز و نیز رعایت استانداردهای جهانی در کنترل کیفی آزمایشات؛ شناسایی، کمیت سنجی، تعیین ژنوتیپ و مقاومت دارویی طیف وسیعی از ارگانیسم های بیماری زا به روش مولکولی را در دستور کار خود قرار داده است و آماده تعامل با جامعه پزشکی در راستای بر طرف نمودن نیازهای تشخیصی و برقراری ارتباط علمی می باشد.
تشخیص مولکولی هپاتیت B
ویروس هپاتیت B یک ویروس DNA داراست و مارکرهای آزمایشگاهی که در تشخیص هپاتیت B حائز اهمیت هستند، شامل: anti-HВs ,НBeAg ,НBsAg ,НBV DNAو anti-HВc می باشند که در سرم بیماران قابل شناسائی هستند. به طور معمول تشخيص هپاتيت B با تعيين وجود HBsAg صورت می گیرد و حضور این آنتی ژن در سرم نشانه عفونت می باشد که ممکن است حاد یا مزمن باشد. در این حالت اگر IgM anti-HBC مثبت باشد، نشان دهنده حاد بودن بیماری است.
مارکرهای سرولوژیکی IgM anti-HBC،HBeAg , HBsAg و نیز HBV DNA به طور متوسط ۸-۴ هفته پس از رویارویی با ویروس افزایش یافته و به سطح قابل شناسایی می رسند، منفی بودن HBsAg تشخیص هپاتیت B را رد نمی کند زیرا ۴۶-۱۲ درصد بیماران مبتلا به نوع حاد بیماری ممکن است در زمان آزمایش، HBsAg منفی باشند که این حالت بیشتر به دلیل انجام شدن آزمایش در مرحله بین منفی شدن HBsAg و مثبت شدن anti-HВs رخ می دهد و در اینجا تشخیص IgM anti-HBC بسیار مفید خواهد بود که در عیار بالا یک مارکر عفونت حاد و یا فعال شدن مجدد عفونت مزمن است.
تیتر پائین IgM anti-HBC همراه با HBsAg دلالت بر عفونت قبلی و ایمنی دارد. در نوع فعال هپاتیت B مزمن، حضور مداوم HBeAg و НBV DNA قابل مشاهده است که نشان دهنده تکثیر ویروس و عفونت زایی بالای سرم فرد آلوده است. شناسایی و اندازه گیری کمی DNAویروس ( Viral Load ) جهت شناسایی عفونت حاد باHBV ضروری نیست و تستهای سرولوژیک کافی به نظر می رسند ولی در عفونت مزمن جهت تصمیم گیری در مورد درمان و بررسی وضعیت پاسخ بیمار به آن بسیار اهمیت دارد.
تشخیص حضور DNA ویروس در صورت مثبت بودن HBe Ag ضروری به نظر نمی رسد ولی به دلیل وقوع موتاسیون هایی در ژنوم ویروس هپاتیت B که منجر به منفی شدن HBeAg می گردند، تعیین НBV DNA در صورت مثبت بودن HBsAg و منفی بودن HBeAg جهت تعیین تکثیر ویروس ضروری به نظر میرسد، همچنین در موارد هپاتیت B پنهان (Occult hepatitis B) ، تشخیص НBV DNA فاکتوری مهم جهت شناسایی عفونت می باشد.
اندازه گیری کمی DNA ویروس می تواند در تصمیم گیری برای درمان موثر باشد به طوری که معمولاً میزان НBV DNA بالاتر از 105 - 104 کپی در میلی لیتر خون به عنوان کاندید درمان در نظر گرفته می شود و نیز چندین یافته نشان داده که در صورتیکه میزان DNA ویروس کم باشد، اینترفرون آلفا پاسخ ضدویروسی پایدارتری ایجاد میکند، در حالی که اگر میزان DNA ویروس زیاد باشد، آنالوگهای نوکلئوزیدی انتخاب بهتری برای درمان هستند، همچنین در مبتلایانی که لامیوودین برای درمان آنها در نظر گرفته می شود، اطمینان از عدم وجود موتاسیون مقاوم به درمان (موتاسیون YMDD) اهمیت دارد که تشخیص این موتاسیون با روشهای مولکولی امکان پذیر است.
به طور کلی در افرادی که به درمان پاسخ می دهند، میزان DNA ویروس به طور قابل ملاحظه ای کاهش می یابد و پاسخ پایدار به درمان به صورت عدم شناسایی НBV DNA به مدت شش ماه پس از درمان توصیف می گردد. همچنین ظهور anti-HBe در بیمارانی که HBeAg مثبت بوده اند، می تواند به عنوان نشانه کاهش تکثیر ویروس و بهبودی بیماری تلقی گردد.
تشخیص مولکولی هپاتیت C
ویروس هپاتیت ( C) HCV یک ویروس RNA دار است و به دلیل جهش هایی که در طول تکثیر از خود نشان می دهد، هتروژنیسیته زیادی دارد به طوری که این ویروس به شش ژنوتیپ و هر ژنوتیپ به چندین تحت گونه تقسیم بندی میگردد. با توجه به عوارض شدید بیماری، شناسایی و پیگیری بیماران مبتلا حائز اهمیت فراوان است و امروزه تستهای آزمایشگاهی مختلفی در این راستا انجام میگیرد که به طور کلی تحت تسو عنوان قابل ارزیابی هستند :
الف) تستهای سرولوژیک که anti-HCV را در سرم یا پلاسما شناسایی میکنند.
ب) تستهای مولکولی که به دو صورت کیفی و کمی انجام شده و شناسایی ژنوم HCV، اندازه گیری میزان ویروس ( Viral Load ) و تعیین ژنوتیپ ویروس را به عهده دارند.
تست اولیه جهت شناسایی عفونت، انجام ELISA جهت نشان دادن anti-HCV می باشد که مزایایی از جمله ارزانی و قابلیت انجام سریع در مقیاس وسیع را دارد، تست مثبت ELISA در جوامع با ریسک پائین مانند اهدا کنندگان خون باید با یک تست آنالیتیک تشخیص آنتی بادی مانند RIBA تایید گردد و در صورتیکه جواب، مثبت یا مشکوک باشد، آزمایشی HCV RNA صورت خواهد گرفت. بر خلاف آن اگر آزمایش ELISA در جوامع با ریسک بالا یا در وضعیتهای مشکوک به عفونت مثبت شود. مستقیماً آزمایش HCV RNAجهت تایید انجام می پذیرد.
در این حالت اگر پاسخ آزمایش ELISA مثبت بوده و HCV RNAمنفی باشد، باید آزمایش RIBA انجام گیرد که منفی شدن آن نشانه پاسخ مثبت کاذب ELISA می باشد و مثبت شدن آن علامت عفونت بهبود یافته است.
آزمایش RIBA اختصاصی تر ولی مشکلتر، وقت گیرتر و تا حدی گرانتر از ELSA است و حساسیت آن در مقایسه با ELISA کمتر می باشد، علیرغم این که تعیین آنتی بادی عملی ترین روش شناسایی عفونت است ولی عدم تمیز عفونت بهبود یافته از عفونت فعال ( به دلیل حضور آنتی بادی تا چند سال پس از بهبودی) از عیوب این روش می باشد.
HCV RNA در مدت کوتاهی (۳-۱ هفته) پس از رویارویی با ویروس قابل ردیابی است. در حالی که تعیین آنتی بادی به طور متوسط پس از ۸-۶ هفته قابل انجام می باشد. همچنین در نوزادان تازه متولد شده از مادران مبتلا و افراد تحت دیالیز مزمن و گیرندگان پیوند و سایر افرادی که دچار نقص ایمنی هستند و آنتی بادی در آن ها قابل شناسایی نیست، روش تعیین HCV RNA جهت تشخیص عفونت مناسب است.
به دلایل فوق تشخیص RNA این ویروسی به عنوان Gold Standard جهت نشان دادن عفونت فعال ویروسی پذیرفته شده است. آزمایش تعیین کمی HCV RNA و تعیین ژنوتیپ در صورتی باید انجام شود که پیگیری بالینی و درمان بیماری مد نظر باشد.
دو فاکتور اخیر در تعیین طول دوره درمان موثر می باشند میزان پایین RNA ویروس (کمتر از 2×106 کپی یا 8×105 IU در میلی لیتر خون) پیش آگهی بهتری برای درمان دارد و درمان شش ماهه برای این بیماران می تواند کافی باشد و در غیر این صورت، درمان باید یک سال ادامه یابد.
ژنوتیپ های 1 و 4 این ویروس در مقایسه با ژنوتیپ های ۲ و ۳، به اینترفرون مقاوم تر هستند به طوری که درمان یک ساله بیماران مبتلا به ژنوتیپ های ۱ و ۴ در ۵۰-۳۰ درصد موارد منجر به بهبودی می شود در حالی که این درصد در مورد ژنوتیپهای ۲ و ۳ پس از درمان شش ماهه، ۸۰-۶۰ درصد می باشد و بنابراین تعیین ژنوتیپ که فقط یک بار نیاز به انجام آن است. برای تصمیم گیری در مورد طول دوره درمان اهمیت دارد.
پاسخ به درمان به صورت کاهش ۱۰۰ برابری میزان HCV RNA پس از ۱۲ هفته تعریف می شود و پاسخ پایدار ویروسی به درمان به صورت عدم شناسایی HCV RNA به مدت حداقل شش ماه پس از کامل شدن دوره درمان توصیف می گردد.
یک نکته مهم در مورد بیماران مبتلا به هپاتیت C این است که به دلیل مشابه بودن نوع ابتلا و شیوع بالا، عفونت همزمان با ویروس هپاتیت B در این بیماران معمول است ولی HCV قادر است مانع بروز مارکرهای سرولوژیکی ویروس هپاتیت B شود و بنابراین آزمایش تشخیص HBV RNA در مبتلایان به هپاتیت C مزمن ضروری به نظر می رسد زیرا عفونت همزمان به این دو ویروس پیش آگهی وخیم تری دارد و ممکن است باعث مقاومت بیشتر در برابر اینترفرون گردد.
آزمایش ) YMDDتست شناسایی مقاومت به لامیوودین (
یکی از داروهای مطرح در درمان هپاتیت B مزمن، لامیوودین (Lamivudine )می باشد که بر روی قسمتی از DNA Polymerase ویروس که تحت نام موتیف YMDD (مخفف اسیدهای آمینه تیروزین، متیونین، آسپارتات) شناخته می شود، اثر می گذارد.
مصرف این دارو معمولاً چند سال و به صورت روزانه ادامه می یابد. مشکلی که در این راستا ممکن است ایجاد شود، مربوط به مقاومت این ویروس نسبت به دارو میباشد، بدین صورت که اسید آمینه متیونین در موتیف YMDD به والین ( YVDD ) یا ایزولوسین (YIDD) تغییر می یابد و ویروس نسبت به دارو مقاوم می گردد،
این مقاومت از ۹ - ۱۰ ماه پس از شروع درمان ممکن است ایجاد شود و نهایتاً در سالهای دوم تا چهارم پس از شروع درمان در ۳۸ تا ۶۷ درصد بیماران تحت درمان مشاهده می گردد، مقاومت نسبت به دارو موجب عود این بیماری خواهد شد و نیاز به اتخاذ تدابیر دیگری از جمله تغییر دارو به وجود خواهد آمد بنابراین نیاز ضروری به شناسایی مقاومت نسبت به دارو وجود دارد،
در شناسایی جهش مقاوم به دارو، روشهای متعددی از جمله Sequencing، PCR-RFLP، SSP-PCR و Real Time – PCR مورد استفاده قرار می گیرند که اساس تمام آنها بر آنالیز DNA ویروس استوار می باشد و بسته به امکانات آزمایشگاهی و حساسیت روش، یکی از آنها مورد استفاده قرار می گیرد.
HLA-Typing for Celiac Disease
در تشخیص بیماری سلیاک سه روش سرولوژیک، HLA-Typingو بیوپسی از روده کوچک قابل استفاده هستند . در حالیکه اندوسکوپی و هیستولوژی دئودنوم روش اصلی تشخیص بیماری سلیاک میباشد ولی دو روش دیگر در تشخیص اولیه و نیز در صورت مبهم بودن تست پاتولوژی مورد استفاده قرار می گیرند. پژوهشها نشان داده اند که مستعد بودن به بیماری سلیاک با آلل های خاصی از HLA کلاس II خصوصاً HLA-DQ مرتبط می باشد.
حدود ۹۵ درصد بیماران مبتلا به سلیاک، هترودیمر 2 HLA-DQ را دارند که توسط آلل های DQ A1*02 و DQ A1*05 کد می شود و حدود ۸۵ درصد دیگر، هترودیمر HLA-DQ 8 را دارند که توسط آلل های DQ A1*032 و DQ B1*0302 کد می گردد.
همچنین در موارد نادر، بیماران فقط یکی از آلل های DQ 2 یعنی DQ A1*05 و DQ B1*02را دارا می باشند. آلل های HLA-DQها در ۶۵-۴۸ درصد بستگان درجه اول بیمار مبتلا به سلیاک و در ۷۳ درصد بیماران مبتلا به دیابت وابسته به انسولین حضور دارند که نشان دهنده ریسک بالای بیماری سلیاک در این گروه افراد می باشد . سایر افراد با ریسک بالا شامل بیماران مبتلا به تیروئیدیت اتو ایمیون، سندروم های داون، ترنر و ویلیامز، نقص انتخابی IgA (Selective IgA Deficiency ) یا افراد با علائم آنمی فقر آهن توجیه نشده (unexplained)و osteoporesis Premature-onest می باشد.
از آنجائیکه ۴۰-۲۵ درصد جمعیت عادی، حامل 2 DQ یا DQ 8 می باشند، حضور هریک از این هترودیمرها نشانه تشخیص بیماری سلیاک نمی باشد. بنابراین استفاده اولیه تعیین آلل های HLA-DQ، حذف احتمال وجود بیماری سلیاک و استعداد ژنتیکی نسبت به این بیماری می باشد .(Rule-out Test)
این آزمایش خصوصا زمانی انجام می شود که نتیجه پاتولوژی روده کوچک مشکوک است یا روشهای سرولوژیک، بیماری را نشان می دهند ولی آتروفی ویلیهای روده دیده نمی شود یا رژیم غذایی فاقد گلوتن بدون حضور علائم پاتولوژی تجویز می شود و یا اینکه برای بستگان درجه اول فرد، سلیاک تشخیصی داده می شود.
با روش HLA Typing و تعیین استعداد ژنتیکی نسبت به این بیماری ، از بیوپسی غیر ضروری روده کوچک. آزمایشات مداوم سرولوژیک و شروع رژیم غذایی بدون گلوتن خصوصاً در افراد با ریسک بالا جلوگیری می شود. بنابراین این آزمایش برای افراد با ریسک بالای بیماری سلیاک و نیز افرادی که تشخیص بیماری سلیاک در آنها مبهم است، توصیه می گردد.
این در حالی است که تستهای سرولوژیک برای تشخیص اولیه بیماری در افراد با ریسک پائین ابتلا به این بیماری مورد استفاده قرار میگیرد عدم وجود آللهای HLA مرتبط با این بیماری، احتمال وجود بیماری را تقریباً منتفی می کند به طوری که ارزش پیشگویی منفی (Negative Predictive Value) این تست ۱۰۰- ۹۵ درصد می باشد. حضور آللهای HLA مرتبط ،به همراه نتیجه مشکوک هیستوپاتولوژی و یا تست مثبت سرولوژیک، نشان دهنده بیماری سلیاک است .
PCR فهرست آزمایشهای مولکولی
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
| (Qualitative) عفونت های ویروسی | |
| نوع نمونه | آزمایش |
| سرم، پلاسما | HBV |
| سرم، پلاسما | HCV |
| سرم، پلاسما | HAV |
| سرم، پلاسما | HDV |
| سرم، پلاسما | HGV |
| سرم، پلاسما | TTV |
| خون،ادرار ،CSF | CMV |
| سرم، پلاسما ،CSF | EBV |
| سرم، پلاسما ،CSF | VZV |
| ضایعه پوستی،پلاسما،سواب واژینال ،CSF | HSV 1 |
| ضایعه پوستی،پلاسما،سواب واژینال، CSF | HSV 2 |
| سرم، پلاسما | HEV |
| سرم، پلاسما ،CSF | Rubella |
| (Qualitative) عفونت های ویروسی | |
| نوع نمونه | آزمایش |
| سرم، پلاسما | HIV |
| خون کامل، سرم، پلاسما | HHV 8 |
| خون کامل | Htlv-1 |
| سرم، پلاسما ،CSF | Parvo Virus B19 |
| سرم، پلاسما، CSF | Mumps |
| سرم، پلاسما ،CSF | Measles |
| سواب واژینال،بیوپسی زگیل | HPV |
| خون کامل، سرم، پلاسما،ادرار | BKV |
| خون کامل، سرم، پلاسما،ادرار | JCV |
| مدفوع،ادرار،خون، CSF | Enteroviruses |
| سرم، پلاسما ،CSF | HHV-6 |
| سرم، پلاسما ،CSF | Adenovirus |
| سرم، پلاسما،CSF | Parechovirus |
| Quantitative Tests | |
| HBV | HIV |
| HCV | CMV |
| BKV | JCV |
| Genotyping Tests |
| HCV |
| HBV YMDD |
| HPV |
| عفونت های باکتریایی Qualitative | |
| نوع نمونه | آزمایش |
| تمام مایعات بدن، پلاسما | Mycobacterium tuberculosis |
| ترشحات مجرا، واژن | Neisseria gonorrhaeae |
| CSF پلاسما و سرم، | Streptococcus pneumoniae |
| ترشحات مجرا، واژن | Chlamydia trachomatis |
| CSF پلاسما و سرم، | Heamophilus influenzae |
| CSF پلاسما و سرم، | Neisseria meningitidis |
| بررسی فاکتورهای انعقادی موتاسیون یافته |
| Factor II, factor v Leiden, MTHFR & Plasminogen Activation inhibitor (PAI) |
| سایر | |
| نوع نمونه | آزمایش |
| خون کامل، سرم | Taxoplasma |
| خون کامل | HLA Typing Class 1,2 |
| خون کامل | Celiac Disease (CD) |
توجه:
۱- کلیه آزمایش های مولکولی در مدت ۷۲ ساعت پاسخ دهی می شوند.
۲- باتوجه به انجام اکثر آزمایش های مولکولی با سیستم Real Time PCR پاسخگویی به آزمایش های اورژانس درصورت درخواست پزشک در مدت ۱ روز امکان پذیر می باشد.